隨著生物制藥和綠色食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，酶催化合成已經(jīng)成為一股強(qiáng)勁的技術(shù)潮流，吸引了很多的技術(shù)人員和資金的投入。能否將的微反應(yīng)技術(shù)和酶催化技術(shù)集成，應(yīng)用于綠色合成過(guò)程呢？

2015年，康寧歐洲技術(shù)中心（法國(guó)）Daniela Lavric博士和斯洛文尼亞的盧布爾雅那大學(xué)（University of Ljubljana）的合作項(xiàng)目成果回答了這個(gè)問(wèn)題。

該聯(lián)合課題組不僅示范了酶催化和微通道反應(yīng)技術(shù)可以地集成，而且可以和膜分離技術(shù)在線集成，實(shí)現(xiàn)“微反應(yīng)+酶催化+膜分離”三元系統(tǒng)集成。

該技術(shù)路線已經(jīng)成功應(yīng)用于乙酸異戊酯（香蕉油）的連續(xù)合成：采用異戊醇，醋酸酐，正庚烷相/緩沖相和Lipase B酶。

合成效率是傳統(tǒng)攪拌釜的20倍，酶活性在回用5次后仍然保持78%以上。成果在2015年5月的第三屆微反應(yīng)器生物技術(shù)應(yīng)用大會(huì)上發(fā)表。

在原料藥合成過(guò)程中，高通量-微通道連續(xù)流反應(yīng)技術(shù)已經(jīng)顯示出（比傳統(tǒng)攪拌釜反應(yīng)工藝）“ge命性的*性”：快速，，清潔-無(wú)放大效應(yīng)；更安全，更環(huán)保，更經(jīng)濟(jì)-更快應(yīng)對(duì)市場(chǎng)等。

原文請(qǐng)參閱：Uroš Novaka,Martin Lubeja, Daniela Lavricb and Polona ?nidarši?-Plazla aUniversity of Ljubljana, Slovenia; Corning S.A.S. France：Continuouslipase B catalysed isoamyl acetate synthesis in a two-liquid phase system usinga Corning® AFRTM module coupled with a membrane separatorenabling biocatalyst recycling.

1.  研究背景

目前，在工業(yè)過(guò)程安全和廢物處理的環(huán)境法規(guī)日漸嚴(yán)格的情況下，連續(xù)流反應(yīng)設(shè)計(jì)與研究都加速發(fā)展。連續(xù)流反應(yīng)器是讓有機(jī)合成更綠色的現(xiàn)代工具之一，與傳統(tǒng)的間歇式工藝相比，使用連續(xù)流反應(yīng)器的流程系統(tǒng)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

l 廢物產(chǎn)生量較低，實(shí)驗(yàn)條件更安全；

l 更傳質(zhì)與傳熱，的溫度控制，可以避免有害的副反應(yīng)；

l 快速的早期反應(yīng)條件優(yōu)化和后期工業(yè)化無(wú)縫放大等。

2019年6月20日，波蘭西里西亞理工大學(xué)（Silesian University of Technology）的Anna Szelwickaa等研究人員在OPRD期刊上發(fā)表了zui新連續(xù)流生物酶催化反應(yīng)的研究成果。

作者研究了在多壁碳納米管上，通過(guò)簡(jiǎn)單的物理吸附固定化的南極假絲酵母脂肪酶B，連續(xù)酶催化Baeyer-Villiger氧化反應(yīng)。

納米生物催化劑用于從乙酸乙酯和30%（重量）水溶液中生成過(guò)酸，過(guò)氧化氫作為主要氧化劑。高穩(wěn)定性和活性納米生物催化劑發(fā)生Baeyer-Villiger反應(yīng)，將2-甲基環(huán)己酮氧化成6-甲基-ε-己內(nèi)酯，得到收率（87％）和選擇性（> 99％） 。

反應(yīng)中使用了環(huán)境友好的乙酸乙酯作為溶劑和過(guò)酸前體。為了確定zui有利的反應(yīng)條件，作者進(jìn)行了各種參數(shù)的一系列實(shí)驗(yàn)，同時(shí)比較了間歇釜與連續(xù)流中固定化酶的回收率。

這項(xiàng)工作的主要貢獻(xiàn)在于它應(yīng)用納米生物催化劑在流動(dòng)系統(tǒng)中 - 酶促Baeyer-Villiger氧化反應(yīng)。

該工藝zui終產(chǎn)物為內(nèi)脂的一種。內(nèi)酯屬于精細(xì)化學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵物質(zhì)，適用于制藥，食品，化妝品，香水和聚合物工業(yè)。精細(xì)化學(xué)品市場(chǎng)預(yù)計(jì)將以5.76％的復(fù)合年增長(zhǎng)率增長(zhǎng)，到2023年將達(dá)到201.57億美元。

在這里，通過(guò)開(kāi)發(fā)流動(dòng)化學(xué) - 酶促連續(xù)工藝，證明了使用連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)器是該類(lèi)化合物綠色化生產(chǎn)的方便可擴(kuò)展的有效方法。

圖1. 研究中使用的流動(dòng)系統(tǒng)圖

2. 實(shí)驗(yàn)部分：

由于篇幅限制，這里著重介紹連續(xù)流工藝。作者進(jìn)行了大量的間歇釜反應(yīng)，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)為不同反應(yīng)體系（包含間歇式與連續(xù)流）下回收的固定化酶活性。

圖2.  化學(xué)酶促Baeyer-Villiger氧化2-甲基環(huán)己酮

有機(jī)相：辛酸與底物和溶劑的混合物

流動(dòng)Baeyer-Villiger工藝：如圖2， 8bar壓力下，泵A泵送有機(jī)相（酮濃度：4.50mmol（0.504g）/ 10mL乙酸乙酯），泵B泵送30%重量的過(guò)氧化氫水溶液（20-80摩爾過(guò)量），總流量設(shè)定為0.040-0.133mL / min。

使用各種停留時(shí)間（12-38分鐘）和恒定量的（納米）生物催化劑（0.5g），在25-55℃下進(jìn)行該過(guò)程2-24小時(shí)。在此過(guò)程中，取樣進(jìn)行GC-FID分析（在0.5mL二氯甲烷中稀釋100μL樣品）。

為了合成6-甲基-ε-己內(nèi)酯，作者開(kāi)發(fā)了的分離方法。

l 在2-甲基環(huán)己酮氧化后，收集反應(yīng)混合物（25mL），向其中加入水（25mL），先使用飽和的水溶液洗滌有機(jī)相，然后碳酸氫鈉溶液（3×25mL）洗滌。

l 接下來(lái)，使用二氯甲烷（3×25mL）萃取收集的水相，將有機(jī)相經(jīng)無(wú)水MgSO4干燥并在減壓下（8mbar，25℃，1h）濃縮。

l 通過(guò)柱色譜法純化殘余物，使用二氧化硅作為固定相，用己烷：乙酸乙酯8：2v / v作為洗脫液，得到90％的內(nèi)酯。

內(nèi)酯類(lèi)化合物進(jìn)一步擴(kuò)展得到了如下表：

表3.  在流動(dòng)反應(yīng)器中進(jìn)行的化學(xué)酶Baeyer-Villiger氧化中底物類(lèi)型對(duì)酮轉(zhuǎn)化的影響

通過(guò)GC測(cè)定酮的轉(zhuǎn)化率如上表，對(duì)內(nèi)酯的選擇性為100％。

3. 實(shí)驗(yàn)總結(jié)：

l 通過(guò)與間歇過(guò)程的比較，證明了流動(dòng)系統(tǒng)在固定化酶催化的Baeyer-Villiger氧化中的應(yīng)用。

l 這種方法保證了產(chǎn)物收率高，并且消除了處理不穩(wěn)定和極其危險(xiǎn)的過(guò)酸的需要。

l 通過(guò)物理吸附固定在商業(yè)上可獲得的未改性MWCNT（Nanocyl NC7000）上的由南極假絲酵母脂肪酶B組成的高活性和穩(wěn)定的納米生物催化劑已使用流動(dòng)化學(xué)進(jìn)行了證明。

實(shí)驗(yàn)證明：30％過(guò)氧化氫可成功用作2-甲基環(huán)己酮氧化成6-甲基-ε-己內(nèi)酯的綠色主要氧化劑。使用溫和的反應(yīng)條件（40℃）在短的反應(yīng)時(shí)間（5分鐘）內(nèi)獲得高轉(zhuǎn)化率的底物（87％），而納米生物催化劑甚至在乙酸乙酯中進(jìn)行該過(guò)程8小時(shí)后也是穩(wěn)定的。

總之，這項(xiàng)工作無(wú)可否認(rèn)地代表了對(duì)內(nèi)酯的化學(xué)酶促氧化的極其有效的方法。在流動(dòng)系統(tǒng)中使用穩(wěn)定的納米生物催化劑已被證明是用于從精細(xì)化學(xué)品領(lǐng)域合成化合物的通用且可擴(kuò)展的方法。

參考文獻(xiàn)：Org. Process Res. Dev., • DOI: 10.1021/acs.oprd .9b00132 •  Publication Date (Web): 20 Jun 2019